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发布时间：2022-06-07 01:10:00 作者：同金化工
先前的结果表明，双变体HLHS是提高对酸类似物（包括氧代丁酸）的底物亲和力的突变体。较小且极性较小的侧链代替两个组氨酸的存在允许扩大较大疏水供体底物的活性位点并保持催化机制完整。将这两个位置与Asp、Leu、Phe或 Leu上的突变连续组合。此外选择L位，它参与稳定 ThDP 的唑循环，并且还可以通过与比 Leu 更长的碳链残基相互作用来稳定脂肪族底物。创建了五个文库，HLHXDX（或 LX、或 FX 或 LX 或 LX）（表 ）。
先前用α-羟基酮-测试的单位点突变体没有裂解 (±) -或 -羟基酮和的C-C 键。转向三重TKgst突变体文库（HLHXDX 或 LX，或 FX，或 LX 或 LX），将先前确定的位置结合起来进行逆向反应（使用脂肪族酮酸作为供体和脂肪醛作为受体形成α-羟基酮）。在大肠BL菌株中表达文库，使用粗提物针对α-羟基酮和进行筛选，并与型TKgst进行比较。根据产物或的斑点强度，通过薄层色谱法(TLC)估计每个文库中的阳性百分比。
通过亲和色谱纯化所有候选物，并使用前面描述的分光光度测定法确定它们对的比活性（Chart ）。虽然型TKgst对没有表现出活性，但与HLHS 相比，包含LI的所有突变体都具有更高的活性，表明该突变对的C-C键切割提供了协同效应。结果（Chart ）表明，用非极性残基如Gly (HLHGLI)代替His 显着提高了活性。Gly和其他两个脂肪族残基提供的疏水环境有利于稳定的非极性头部（）（图）。
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